فصل سوم

روش شناسی

3-1 مقدمه:
ابتدا سویه¬های مخمرهای پروبیوتیک شناسایی خواهد شد. پس از کشت ابتدایی مخمرها بر روی محیط کشت اختصاصی جامد مخمرها، به کشت آنها در محیط کشت مایع اقدام خواهد شد. مخمرهای رشد یافته در این محیط، برای کشت در مقیاس بیشتر، به داخل ارلن¬های یک لیتری منتقل و کشت داده می¬شوند. در نهایت مخمر حاصله پس از سانتریفیوژ، با سرم فیزیولوژی استریل، شستشو داده شده و تا زمان غذا دهی در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری خواهد شد (پورقدیمی، 1390). پس از تهیه استوک اولیه مخمرها در سویه¬های مختلف، تمامی سویه¬های فوق با استفاده از محیط¬های کشت مختلف (YPD، YPAD، YPAC، YPG و DM) در حداقل 3 تکرار در اپتیمم شرایط پرورشی کشت داده خواهند شد (Hahn-Hagerdal et al, 2005) و در انتهای هر دوره¬ی پرورشی میزان تراکم مخمر با تکنیک شمارش بر روی لام هموسیتومتر با نمونه¬های شاهد و با یکدیگر مقایسه و بررسی خواهند شد. همچنین جهت بررسی توان تولید الکل، میزان تولید اتانول در هر تیمار به روش GC/FID بررسی شده و با نمونه¬های شاهد و با یکدیگر مقایسه می¬شوند (Corseuil et al, 1998؛ Alvarez , 1999).
3-1-1 جامعه¬ی آماری:
نتایج کمی و کیفی سویه¬های مخمرها، به عنوان جامعه آماری مورد انتظار در این تحقیق می¬باشد. در هر دوره آزمایش تعداد مخمرهای تولید شده، با برداشت یک میلی لیتر از هر نمونه کشت با رقیق سازی در درون بالن ژوژه مورد شمارش قرار خواهد گرفت و جهت بررسی میزان تولید الکل اتانول نیز به همان میزان، نمونه از هر تیمار محیط کشت برداشت شده و با استفاده از تکنیک گاز کروماتوگرافی اشاره شده، بررسی خواهد شد.
3-2 مواد و دستگاههای مورد نیاز‌
3-2-1 دستگاهها
سانتریفیوژ (Eppendorf 5417R)، هموسیتومتر، انواع پیپت، مایکروویو، لام، اتوکلاو (ایران تولید، ایران) انکوباتورثابت (فن¬آزما،-ایران)، انکوباتورشیکر (Biotek,¬South¬Korea)، میکروسکوپ¬نوری (Zeiss, Germany)، دستگاه PH¬ متر (HANA,USA)، ترازوی ¬دیجیتالی (300i, EKAND)، هود لامینار )بعثت، ایران(، سانتریفیوژ (Sigma Laboratury Centrifuge, Germany).
3-2-2 مواد
سویه¬های مخمری، ارلن مایر شیشه¬ای 2 لیتری و 1 لیتری، اسید استیک، دکستروز (گلوکز)، آب مقطر، سرم فیزیولوژی، محیط کشتSDA ، پپتون، استات سدیم، گلیسرول، لوله¬ی آزمایش، انواع سمپلر وسرسمپلرها، آب دیونیزه، محلولهای رنگ آمیزی گرم (کریستال ¬ویوله، لوگل، الکل استن و سافرانین)، Ca(NO3)2.4H2O، KH2PO4، MgSO4.7H2O، NaHCO3، EDTAFeNa، EDTANa2، H3BO3، MnCl2.4H2O، Cyanocobalamin، Thiamine HCl، (NH4)6Mo7O24.4H2O، Biotin، الکل 70%، پنبه، محیط کشت Mycosel Agar، محیط کشت CHA (کروم آگار کاندیدا)، محیط کشت CMA (corn meal agar)، فالکون تیوپ های 50 میلی¬لیتری استریل (BioPhil ٫Germany)، آدنین همی سولفات0.004%، فیلترسر سرنگی 0.2، K2HPO4، عصاره¬ی مخمر (YEAST EXTRACT)، لامل سنگی، لام نئوبار، پیپت¬های شیشه¬ای استریل، یخدان، یخ، ماهی قزل¬آلا، آنس یا فیلدوپلاتین (لوپ و نیدل)، استوانه¬ی مدرج، بشر شیشه ای، سه پایه، تور سیمی نسوز، vortex، لاکتوفنول کاتن بلو، KOH ، پارافیلم، چسب اتوکلاو، محفظه ی مرطوب، اسپاتول، پوآر.

3-3 جمع آوری و کشت نمونه¬ها
نمونه برداری از ایستگاههای نمونه برداری در خرداد سال 1392 انجام شد. بدین منظور تعداد 15 نمونه از ماهیان قزل¬آلای رنگین¬کمان از 6 ایستگاه (مزرعه) پرورش ماهی استان اخذ شد. ماهیان بلافاصله در داخل یخ به آزمایشگاه منتقل شدند (شکل 3-1 و جدول 3-1).

مطلب مرتبط :   شهروندان، زندگی،، سلامتی، و...

شکل 3- 1 جمع آوری ماهی قزل آلا از ایستگاه های پرورش ماهی
جدول 3-1 آدرس و نام کارگاه های اخذ ماهی
کد ماهی آدرس ایستگاه نام کارگاه پرورش ماهی
A میرشکارلو ماهی سرای غلام پور متین
B جاده اشنویه ماهی سرای رشد کن رضایی
C جاده بالانج- سارالان مزرعه ی قائم وزیری
D زیوه کارگاه تولیدی و پرورش ماهی وهابی
E جاده سرو – هنگروان کارگاه پرورشی شفاف بالیق دکتر مدیری
F دانشگاه ارومیه استخرهای پرورشی پژوهشکده آرتمیا و آبزیان

3-3-1 تشریح ماهی
ابتدا ماهی به پهلو بر روی یک تخته تشریح قرار ¬داده شد. سطح بدن ماهی با یک پنبه و الکل 70% پاک شده و سپس با یک پنس دندان موشی شکم ماهی از ناحیه قرار گرفتن باله لگنی گرفته و برای بریدن قسمت شکمی و دیواره شکم از ناحیه بین دو باله شکمی به طرف جلو تا حفره پریکاردیدمی از یک اسکالپل با یک تیغه منحنی استفاده شد (شکل شماره 3-2). با بریدن دیواره شکم در جهت معکوس قسمت باقیمانده حفره شکمی باز شد. باید احتیاط شود که راست روده ماهی شکاف داده نشود (لیدا براون،1380). محتویات روده را به کمک پنس استریل از روده جدا نموده و از آن رقت¬های سریال تهیه شد (ظهوریان، 1389) (شکل 3-2).

شکل 3- 2 روش تشریح و باز کردن حفره شکمی در ماهی (لیدا براون،1380)

3-3-2 تهیه رقت
5/0گرم از محتویات روده در کنار شعله وزن شد و در داخل 5/4 میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل، حل (برای تهیه محلول stock) و پس از اینکه بخوبی مخلوط گشت، 100میکرولیتر از آن به لوله¬ی دیگر که حاوی 5/4 میلی لیتر سرم فیزیولوژی است منتقل شد (برای تهیه رقت 1-10) و این عمل تا لوله¬ی آزمایش آخر انجام شده و در نهایت 100میکرو لیتر از محتویات لوله¬ی آخر دور ریخته شد (ظهوریان، 1389) (شکل 3-3).
نکته : هر بار قبل از برداشتن نمونه ی داخل لوله ها، محتویات را کاملاً بهم نموده تا مخلوط همگن و یکدستی ایجاد گردد.

شکل 3- 3 روش تهیه¬ی رقت های سریال (ظهوریان، 1389)

3-3-3 کشت رقت¬ها در محیط کشت SDA
در ادامه مقدار 100 میکرومتر از هر یک از این رقت¬ها در پلیت¬های استریل جداگانه با روش پورپلیت در محیط SDA کشت داده شد (ظهوریان، 1389). نحوه¬ی انجام این روش بدین صورت است که مقدار 100 میکرومتراز تمام رقت¬ها بطور جداگانه در پلیت استریل ریخته شد و بلافاصله روی آن محیط SDA تازه که قبلاً با اتوکلاو استریل و در دمای اتاق تا حدودی خنک شده، اضافه گشت و درب پلیت¬ها گذاشته شد و پلیت به شکل ∞ انگلیسی خوابیده روی سطح صاف میز کاری حرکت داده شد تا به مدت یک دقیقه کاملاً مخلوط گردد. با توجه به اینکه محیط SDA حاوی آگار نیز می¬باشد، نبایستی بیش از حد داغ باشد زیرا در این صورت تمام میکرو¬ارگانیسم¬ها از بین رفته و رشدی مشاهده نخواهد شد. سپس پلیت¬های حاوی محیط تا انعقاد کامل رها شد و نهایتاً در دمای 27 درجه سانتی گراد به مدت 24 تا 48 ساعت انکوبه گشت (ظهوریان، 1389) (شکل 3-4 و 3-5).

مطلب مرتبط :   عقل، فقهی، قبح، حدیث

شکل 3- 4 کشت به روش پورپلیت

شکل 3- 5 اشکال متنوع مجموعه کلنی های رشد یافته در محیط SDA با روش کشت پورپلیت

پس از سپری شدن زمان مذکور و رشد کلنی¬ها، آنها بر اساس اندازه، شکل حاشیه یا لبه¬ی کلنی و تولید رنگیزه (پیگمان) مجدداً در پلیت جداگانه با روش کشت سطحی بر روی محیط SDA کشت داده شدند. در ادامه انکوباسیون در دمای cْ 25 به مدت 48-24 ساعت صورت پذیرفت (ظهوریان، 1389؛ Black , 1999) (شکل 3-6).

شکل3- 6 روش کشت سطحی

3-3-4 ایزوله نمودن کلنی ها در محیط کشت Mycosel Agar
برای ایزوله کردن تک کلنی¬ها¬ی مخمری از کلنی¬های باکتریایی و قارچ¬های ساپروفیت، کشت مجددی با همان روش روی محیط Mycosel Agar ( scc) انجام شد. برای تهیه¬ی این محیط کشت 36 گرم از پودر آماده¬ی محیط فوق را در یک لیتر آب دیونیزه حل وPH آن بررسی شد تا مقدار آن 6.9 شود. سپس محلول جوشانده تا شفاف گشت و نهایتاً در دمای 118 درجه ی سانتی گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شد. سپس محیط کشت داخل پلیت¬های استریل ریخته شد. پس از بسته شدن محیط¬های کشت آنها را در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت انکوبه نموده و سپس آماده¬ی کشت شدند. در ادامه کشت کلنی¬ها به روش کشت سطحی صورت گرفت و در دمای c0 25 به مدت 48-24 ساعت انکوبه گردید (ظهوریان، 1389 ).
در نهایت برای اطمینان کامل از مخمر بودن کلنی¬های ایزوله شده، از دو روش تشخیص میکروسکوپیک استفاده شد. بدین منظور روش رنگ آمیزی با معرف لاکتوفنول کاتن بلو انجام شد برای انجام این روش یک قطره از معرف مذکور وسط لام شیشه ای ریخته شد و یک کلنی از نمونه بر روی معرف افزوده شد و با آنس استریل مخلوط گشت و در نهایت با قرار دادن لامل روی آن، لام را داخل محفظه¬ی مرطوب قرار داده و بررسی میکروسکوپی نمونه انجام گشت (دیبا،1390). در روش دوم لام رنگ¬آمیزی گرم تهیه شد (ظهوریان، 1389؛ میرباقری و همکاران1390؛ Deak et al, 2000) و زیر میکروسکوپ شکل سلولی هر کلنی مشاهده شد (شکل 3-7).

شکل 3- 7 مشاهده میکروسکوپی نمونه¬ها

3-4 شناسایی مخمرها در محیط¬های کشت اختصاصی
بعد از ایزوله سازی به منظور شناسایی جنس مخمرها از دو محیط کشت CHA و CMA استفاده شد.
الف- تهیه محیط کشت CHA (کروم آگار کاندیدا)
طبق دستورالعمل