مخمر، دیونیزه، اتوکلاو، استریل

شرکت سازنده 47.7 گرم از پودر محیط کشت در یک لیتر آب دیونیزه حل شد و محلول حاصل روی شعله جوشانده و شفاف گردید. این محیط نیازی به اتوکلاو ندارد. بنابراین پس از شفاف شدن در دمای اتاق خنک شد و در پلیت استریل ریخته و پس از بسته شدن محیط¬های کشت آنها را در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت انکوبه نموده و سپس آماده¬ی کشت شدند.
کشت در محیط CHA با همان روش کشت سطحی انجام شد و پلیت¬ها در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه گردیدند؛ بررسی رنگ اختصاصی تولید شده در هر پلیت یک بار24 ساعت پس از کشت اولیه و بار دوم 48 ساعت پس از کشت اولیه صورت گرفت (Paritpoke et all, 2005) (شکل 3-8).

شکل 3- 8 تنوع رنگ های مشاهده شده بر روی محیط کروموژنیک

ب‌- محیط کشت CMA
با توجه به اینکه محتویات این محیط شامل Corn Meal Extract (2 گرم در لیتر) و آگار (15 گرم در لیتر) می¬باشد بنابراین طبق دستورالعمل روی بطری محیط کشت، مقدار 17 گرم از پودر محیط کشت در یک لیتر آب دیونیزه حل و روی شعله جوشانده و شفاف شد و در دمای 121 درجه¬ی سانتی گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو گشت تا استریل شود. پس از بسته شدن محیط¬های کشت آنها را در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت انکوبه نموده و سپس آماده¬ی کشت شدند (Kelly&Funigiello, 1959 ).
کشت در محیط کشت CMA با روش Dalmau methodانجام شد، بدین صورت که در نوک آنس مقدار کمی از کلنی مخمر به صورت دو خط موازی نزدیک به هم داخل آگار تلقیح شد؛ عمق شیارها باید به قدری باشد که آگار پاره نشود، در نهایت لامل استریلی روی خطوط تلقیحی قرار داده شد. سپس در دمای 28 تا 30 درجه ی سانتی¬گراد به مدت 48 تا 72 ساعت انکوبه شدند (larone , 1939) (شکل 3-9 و شکل 3-10).

شکل 3- 9 نحوه ی کشت در محیط CMA

شکل 3- 10 تنوع سودوهایف های مشاهده شده بر روی محیط CMA
با توجه به اینکه ظاهر میکروسکوپی بسیاری از مخمرها بر روی محیط کشت CMAاختصاصی بوده و ممکن است آن دسته از مخمرهایی را که اختصاصات بیوشیمیایی مشابهی دارند را از هم تفکیک کنند بنابراین جنس¬های مخمری با اطمینان از هم تفکیک شدند ( دیبا،1390). سپس با استفاده از روش¬های مولکولار به طور دقیق¬تر جنس و گونه¬ و سویه¬ی مخمرها شناسایی گردید.
3-5 کشت¬کلنی¬های مخمر در محیط کشت مایع غنی سازی مخمر
برای تکثیر مخمر از محیط کشت غنی سازی مخمر استفاده شد. این محیط کشت به صورت مایع بوده و برای تهیه ی 90 میلی لیتر از آن، مواد به مقادیر زیر استفاده شد: آب دیونیزه شده 90 میلی لیتر، گلوکز 5 درصد 5/4 گرم، عصاره مخمر 8/1 گرم، K2HPO4 9/0 گرم. برای تهیه¬ی این محیط ابتدا در یک ارلن به میزان 950 میلی لیتر آب دوبار تقطیر (دیونیزه) اضافه گردید و مواد نامبرده بجز گلوکز به آن اضافه شد، PH بررسی گشت تا میزان آن برابر 6 شود (با استفاده از استیک اسید یا NaOH به رنج ذکر شده رسید) سپس به مدت 15 دقیقه در دمایc ْ 121 در اتوکلاو قرار گرفت تا استریل شود، سپس 4.5 گرم گلوکز را در 50 میلی لیتر آب مقطر حل و با فیلتر در کنار شعله داخل محیط استریل اضافه شد و در داخل لوله¬های آزمایش استریل 20 میلی لیتر از محیط ریخته شد؛ سپس 1گرم از مخمر به آن اضافه شده و به مدت 48 ساعت در دمای c ° 26در انکوباتور شیکر دار قرار گرفتند. (Aoki et al, 2002) (شکل 3-11).

مطلب مرتبط :   بوم، تعهدات، اعتماد، اجتماعی،

شکل 3- 11 قرارگیری نمونه های مخمری تلقیحی به محیط کشت مایع غنی سازی مخمر داخل انکوباتور شیکردار

بعد از مدت گذرانده شده در دور 3500 rpm و مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند و محلول رویی دور ریخته شد و روی رسوب باقی مانده سرم فیزیولوژی ریخته شد و این مراحل چندین مرتبه تکرار گشت تا رنگ محلول پس از سانتریفیوژ بی¬رنگ شود. مخمر باقی مانده با سرم فیزیولوژی شستشو داده شده و تا زمان مصرف در دمای c0 20- نگهداری شد (Aoki et al, 2002) (شکل 3-12).

1- ریختن داخل فالکون 2- سانتریفیوژ 1. 3- اوت کردن مایع رویی 2. 4- ریختن سرم فیزیولوژی

3. 5- ادامه ی شستشو تا مایع رویی بی رنگ شود. 4. 6- بی رنگ شدن مایع رویی 5. 7- اوت کردن مایع رویی 6. 8- ریختن رسوبات داخل میکروتیوپ

شکل 3- 12 مراحل تهیه ی رسوب مخمر از محیط کشت مایع غنی سازی مخمر

3-6 کشت در محیط های انتخابی مایع
3-6-1 تهیه¬ی استوک اولیه¬ی مخمرها برای کشت در انواع محیط¬های کشت مخمری
ابتدا 35 میلی گرم از کلنی مخمری (یا توده زیستی) به میکروتیوپ منتقل شده و 350 میکرولیتر سرم فیزیولوژی به آن افزوده و مخلوط شد. این مقدار به 3 قسمت 100 میکرولیتری تقسیم گشت و 50 میکرو لیتر باقی مانده برای شمارش تعداد سلول¬های مخمری اولیه نگهداری شد.

3-6-2 محیط کشت مایع YPD
با توجه به اینکه محتویات محیط کشت برای تهیه حجم یک لیتر شامل: عصاره¬ی مخمر 1% به میزان 10 گرم، پپتون 2% به مقدار20 گرم و دکستروز (گلوکز) 2% به مقدار20 گرم می¬باشد، نکته¬ی شایان ذکر در تهیه¬ی این محیط آن است که ابتدا عصاره¬ی مخمر و پپتون در حجم مورد نیاز آب دیونیزه مخلوط شد و در اتوکلاو 121 درجه به مدت 15 دقیقه قرار گرفت و پس از اتمام استریلاسیون، محتویات محیط کشت در دمای 55 درجه ی سانتی¬گراد قرار گرفته و نهایتاً مقدار دکستروز (گلوکز) با فیلتر وارد محتویات استریل، شد و در شرایط کاملاً استریل 10 میلی لیتر از محیط به داخل لوله¬های آزمایش انتقال داده شد تا آماده¬ی کشت نمونه¬های مخمری گردند (شکل 3-13و 3-14).

شکل 3- 13 افزودن دکستروز توسط فیلتراسیون برای تهیه محیط کشت YPD

مطلب مرتبط :   بزهکاری، r)،، میدهد.، خشونت

شکل3- 14 محیط کشت مایع YPD (سمت راست پس از تلقیح نمونه ی مخمری، سمت چپ قبل از تلقیح)

3-6-3 محیط کشت مایع YPAD
محتویات این محیط برای یک لیتر شامل: عصاره ی مخمر1% به میزان 10 گرم، پپتون2% به مقدار 20 گرم، دکستروز (گلوکز)2% به مقدار 20 گرم و آدنین همی سولفات 0.004% به مقدار 40 میلی گرم می-باشد. عصاره¬ی مخمر و پپتون و آدنین همی سولفات با توجه به دستورالعمل فوق با آب دیونیزه ترکیب شد و در دمای 121 درجه به مدت 15 دقیقه اتوکلاو گشت. پس از اتمام اتوکلاو در دمای 55 درجه خنک شد، سپس دکستروز با فیلتراسیون به محلول اضافه گشت. در شرایط کاملاً استریل 10 میلی لیتر از محیط را به داخل لوله¬های آزمایش انتقال داده تا آماده¬ی کشت مخمرها گردند (www.clontech.com).

3-6-4 محیط DM (Diatom Medium)
ترکیب و محتویات محیط کشت DM در جدول ذیل خلاصه شده هست (جدول 3-2).

جدول 3-2 محتویات محیط کشت
( استوک برای 200 میلی لیتر)

Ca(NO3)2.4H2O 4.00 g

KH2PO4 2.48 g
MgSO4.7H2O 5.00 g
NaHCO3 3.18 g
EDTAFeNa 0.45 g
EDTANa2 0.45 g
H3BO3 0.496 g
MnCl2.4H2O 0.278 g
(NH4)6Mo7O24.4H2O 0.20 g
Cyanocobalamin 0.008 g
Thiamine HCl 0.008 g
Biotin 0.008 g

مواد فوق بجز اسید آمینه¬ها در حجم 200 میلی لیتر آب دیونیزه حل شد و pH آن با HCl یک مولار سنجیده شد تا مقدار آن 6.9 گردد. سپس در دمای 121 درجه به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شده تا استریل گردد. در نهایت اسید آمینه¬ها در حجم مشخصی از آب دیونیزه حل شده و با فیلتر وارد محلول استریل شده گشت. در ادامه حجم 10 میلی لیتر از آن در لوله¬های آزمایش ریخته شد (Beakes et al, 2002) (شکل 3-15).

شکل 3- 15 محیط کشت DM قبل از تلقیح نمونه¬ی مخمر

3-6-5 محیط کشت YPG
محتویات این محیط در یک لیتر آب دیونیزه شامل: عصاره¬ی مخمر 1% به میزان 10 گرم، پپتون2% به مقدار 20 گرم و گلیسرول 3%v/v به مقدار 30 میلی لیتر می¬باشد. برای تهیه¬ی این محیط کشت طبق دستورالعمل عصاره¬ی مخمر، پپتون و گلیسرول در حجم مشخص آب دیونیزه مخلوط گشت و سپس در دمای 121 درجه ی سانتی گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو گشت و در لوله¬های آزمایش حجم 10 میلی لیتر از آن انتقال یافت
(www.openwetware.org).

3-6-6 محیط کشت YPAC
محتویات محیط کشت برای تهیه¬ی یک لیتر شامل: استات سدیم 1% به میزان 10 گرم، عصاره¬ی مخمر 2% به مقدار 20 گرم و پپتون 20 گرم می¬باشد. طبق دستورالعمل برای تهیه¬ی این محیط کشت استات سدیم، عصاره¬ی مخمر و پپتون در آب دیونیزه حل شد و اتوکلاو در دمای 121 درجه ی سانتی گراد به مدت 15 دقیقه انجام گرفت و نهایتاً مقدار 10 میلی لیتر به لوله¬های آزمایش انتقال یافت (www.clontech.com) (جدول 3-3).

جدول 3- 3 محتویات تمام محیط های کشت اختصاصی مخمر

محتویات محیط های کشت (گرم بر لیتر) YPD YPAD YPAC YPG DM
عصاره ی مخمر 1% 10گرم 10گرم 20گرم 10گرم –
پپتون 2% 20گرم 20گرم 20گرم 20گرم –
دکستروز(گلوکز) 2% 20گرم 20گرم – – –
آدنین همی سولفات0.004% – 0.04 گرم – – –
گلیسرول3% – – – 0.03 گرم –
استات پتاسیم1% – – 10گرم – –
Ca(NO3)2.4H2O – – – – 2