شکل، مخمری، برجسته، (شکل

0 گرم
KH2PO4 – – – – 12.4گرم
MgSO4.7H2O – – – – 20گرم
NaHCO3 – – – – 15.9گرم
EDTAFeNa – – – – 2.25گرم
EDTANa2 – – – – 2.25گرم
H3BO3 – – – – 2.48گرم
MnCl2.4H2O – – – – 1.39گرم
(NH4)6Mo7O24.4H2O – – – – 1گرم
Cyanocobalamin – – – – 0.04گرم
Thiamine HCl – – – – 0.04گرم
Biotin – – – – 0.04گرم

3-6-7 روش کشت در محیط¬های کشت مایع
از تمام مخمرهای شناسایی شده، مقدار 100 میکرولیتر در لوله¬ی حاوی 10 میلی لیتر از محیط¬های کشت وارد شد و در دمای 25 تا 27 درجه ی سانتی گراد به مدت 48 ساعت انکوبه گشتند.

3-7 شمارش سلول¬های مخمری در لام هموسیتومتر
شمارش با استفاده لام نئوبار انجام شد. برای این منظور ابتدا لامل سنگی لام نئوبار را روی لام قرار داده و از نمونه¬ی مخمری در بین لامل و لام تزریق کرده و تعداد سلول¬های مخمری زیر میکروسکوپ یادداشت شد (Corseuil et al, 1998؛ Alvarez , 1999) (شکل 3-16).

شکل 3- 16 هموسیتومتر

3-7-1 شمارش سلول های مخمر با هموسیتومتر
تعداد سلول¬های شمارش شده توسط فرمول ذیل شمارش و محاسبه شد (شکل 3-17 و 3-18).
تعداد سلولهای مخمر شمارش شده × 1000 × عدد رقت بکاررفته ( در صورت رقیق شدن ) ÷ { 0.0025 × 16 × 5 ( تعداد خانه¬های شمارش شده ) × 0.1} ₌ تعداد سلول¬ها در هر میلی لیتر از محیط کشت مایع

شکل 3- 17 شمارش سلول های مخمری زیر میکروسکوپ

شکل 3- 18 مشاهده ی میکروسکوپی سلول ها در هموسیتومتر

3-8 بررسی میزان اتانول
به منظور بررسی میزان تولید اتانول از محیط¬ کشتی که در آن سویه¬های مختلف مخمری بهترین میزان رشد و تنوع را نشان داده بودند (YPAD)، استفاده شد. جهت تولید الکل مخمرهای مورد نظر به مدت 10 روز در محیط کشت YPAD و در داخل لوله¬های آزمایش 200 میلی لیتری در شیکر انکوباتورهای ویژه کشت داده شدند. پس از انجام سانتریفیوژ در 9000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه زیست توده¬ی مخمرها از این محیط کشت مایع جدا شده و از فیلتر 0.22 میکرون تصفیه شدند. انجام آنالیز دستگاهی سنجش اتانول با استفاده از دستگاه گاز کروماتو¬گرافی با شناسگر FID انجام شد. این بخش از تحقیق در آزمایشگاه تحقیقاتی پزشک قانونی استان آذربایجان غربی اجرا گشت. نتایج بصورت درصد در میزان محیط کشت مایع محاسبه و نمایش داده شد (3-19).

شکل 3-19 دستگاه گاز کروماتوگرافی

فصل چهارم

تجزیه و تحلیل داده ها

4-1 مقدمه:
نتایج مربوط به شناسایی مخمرهای فلور روده ماهیان قزال¬آلای شهرستان ارومیه و بررسی کمی و کیفی آنها در محیط¬های کشت مختلف؛ همچنین متعاقب با شمارش نمونه¬های مخمری کشت یافته در محیط¬های کشت مختلف، بررسی میزان تولید اتانول در آنها مورد استفاده قرار گرفتند. نتایج به ترتیب ذیل ارائه شده است.

4-1-1 بخش اول: جمع¬آوری و آماده سازی نمونه¬ها برای کشت

الف: دمای بالا و یخ زدن ماهی به مدت طولانی بیش از یک روز؛ ممکن است بر روی فلور میکروبی روده تاثیر بگذارد به عنوان مثال اگر ماهی بعد از صید در دمای بالا به آزمایشگاه منتقل شود ممکن است در اثر فعال شدن مکانیسم فساد ماهی (فعال شدن آنزیم¬ها) محیط داخلی روده اسیدی شود و باعث از بین رفتن میکروب¬ها یا مخمر¬هایی شود که به حالت اسیدی مقاومت ندارند؛ و یا یخ زدن ماهی به مدت طولانی نیز ممکن است باعث شود مخمر¬ها یا باکتری¬هایی که به دمای انجماد مقاومتی ندارند از بین بروند. بدین منظور منظور نمونه برداری بطور مستقیم پس از صید ماهی از کارگاه پرورش و در کوتاهترین فاصله زمانی انجام شد.
ب: ظاهر و رنگ قوام مدفوع ماهیان در هر ایستگاه بر اساس نوع آب و احتمالاً نوع تغذیه متفاوت بود. مدفوع¬ها به حالت¬های بسیار آبکی، سفت و بسیار سفت و یا به علت وجود جلبک در آب استخر حاوی جلبک در مدفوع، مشاهده شد (جدول 4-1).
جدول 4- 1 ظاهر و رنگ قوام مدفوع ماهی¬ها¬ی هر ایستگاه
ماهی سرای غلام پور متین ماهی سرای رشد کن رضایی مزرعه ی قائم وزیری کارگاه تولیدی و پرورش ماهی وهابی کارگاه پرورشی شفاف بالیق دکتر مدیری استخرهای پرورشی پژوهشکده آرتمیا و آبزیان

مطلب مرتبط :   شیعه، عالمان، دینی، شاه

4-1-2 نتایج مربوط به شناسایی جنس مخمرهای جدا شده از روده¬ی ماهی قزل¬آلای رنگین کمان

نتایج اولیه بررسی کلنی¬های حاصل شده بر روی محیط¬های کشت مختلف نشان داد که در مجموع 39 کلنی مخمر و 42 کلنی باکتری از کشت محتویات روده مخمرها حاصل شده است. صحت کلنی مخمر بعد از 48 ساعت انکوبه نمودن به صورت ماکروسکوپی از روی رنگ کلنی و بررسی میکروسکوپی پس از رنگ آمیزی انجام پذیرفت (جدول 4-2).
جدول 4-2 نتایج بررسی ماکروسکوپی، تنوع شکل تعدادی از کلنی ها در محیط SDA به روش پورپلیت
شماره ماهی رقت شکل کلنی توضیحات
1 A1 10-2
ستاره¬ای شکل با یک حالت کروی زیرش، زرد روشن
2 A1 10-2
ستاره¬ای برجسته و بزرگ، سفید رنگ
3 A2 10-2
لوزی برجسته، زرد مایل به نارنجی
4 A2 10-2
گرد بزرگ، موکوسی و براق، کرم روشن
5 A3 10-1
گرد با حاشیه مضرس و مرکز برجسته و نافی شکل، بی رنگ
6 A3 10-2
بیضی بسیار ریز داخل محیط کشت رشد کرده بود
7 C2 10-1
گرد متوسط، شفاف، یک ناحیه دکمه مانند تیره در وسط
8 C1 10-1
شکل کلنی نامنظم، موکوسی تقریبا شفاف و براق، کرم روشن
9 A2 10-1
گرد متوسط، وسط کلنی برجسته تر،صورتی و شفاف
10 B3 10-3
گرد بزرگ، مات با یک برجستگی در وسط کلنی، زرد
11 B3 10-3
گرد ریز، سطح صاف، مات، سفید مایل به کرم
12 D1 10-2
گرد یا حلالی، مات، یک ناحیه برجسته در وسط، نارنجی
13 D1 10-2
گرد بزرگ، سفید،سطح چین چین در وسط کلنی برجسته
14 E2 10-3
گرد متوسط، برجسته با حاشیه مضرس، کرم روشن
15 E2 10-3
بیضی نوک تیز ریز داخل محیط کشت رشد کرده بود، زرد
16 E1 10-2
گرد بزرگ،کاملا موکوسی، زرد روشن
17 E3 10-2
شکل کلنی نامنظم متوسط با حاشیه مضرس برجسته، کرم
18 E3 10-2
گرد ریز داخل محیط کشت رشد کرده بود، کرم
19 ماهی پژوهشکده
گرد متوسط، برجسته و خامه ای،کرم مایل به زرد
20 مخمر خوزستان
گرد متوسط برجسته، پنیری، کرم روشن

مطلب مرتبط :  

در مرحله بعدی با انتخاب کلنی¬های کاملاً مستقل و مجزا و کشت سطحی بر روی محیط SDA در دمای 25 درجه سانتی¬گراد به مدت 48-24 انجام شد (Black , 1999) (شکل 4-1).

شکل 4- 1 کشت مجدد تک کلنی¬های رشد یافته در محیط SDA با روش کشت سطحی
در نهایت با تهیه¬ی لام و رنگ آمیزی گرم از هر تک کلنی؛ شناسایی دقیق مخمرها از باکتری¬ها محقق شد (میرباقری و همکاران،1390؛Deak et al., 2000 ) (جدول 4-3).
جدول 4-3 شکل میکروسکوپی تعدادی از کلنی ها

مخمر
نمونه ترکیبی مخمر و باکتری

باسیل بلند
مخمر

کوکوباسیل گرم منفی
مخمر

کوکو باسیل گرم منفی
مخمر

تک¬کلنی¬های مخمری پس از شناسایی میکروسکوپی چندین بار بر روی محیط کشت SDA با روش کشت سطحی مجدداً کشت داده شدند تا کاملاً ایزوله و خالص شوند (Larone , 1939) (شکل 4-2).

شکل 4- 2 کشت مجدد یک کلنی در محیط کشت SDA برای خالص سازی به ترتیب از راست به چپ

4-2 ایزوله سازی و شناسایی جنس به کمک محیط¬های کشت افتراقی CHA و CMA
در تعدادی از پلیت¬هایی که قبلاً کلنی¬های تکی روی محیط کشت SDA کشت داده شده بودند بعد از چند هفته کلنی¬هایی با شکل و رنگ و قوام متفاوت رشد کرد. به منظور ایزوله نمودن نمونه¬های مخمر از کلنی¬های باکتریایی ابتدا تک¬کلنی¬ها روی محیط کشت SCC که حاوی کلرآمفنیکل و سیکلوهگزآمید است کشت داده شد (شکل 4-3 و 4-4).

شکل 4- 3 A) کلنی های یکدست یکی از تک کلنی های کشت داده شده روی محیط کشت SDA؛ 48 ساعت پس از کشت. B) همان پلیت 3 هفته پس از کشت.

شکل 4- 4 کشت تک کلنی ها در محیط SCC برای حذف کلنی¬های باکتریایی
به منظور شناسایی و اطمینان از ایزوله شدن این نمونه¬ها در مرحله بعد از هر نمونه روی محیط CHA کشت مجدد داده شد. این محیط کشت به دلیل داشتن مواد رنگ¬زا (کروموژنیک) باعث می¬شود تا هر گونه رنگ اختصاصی و ویژه خود را نمایان کند. مرحله شناسایی بعدی بر اساس نوع رنگ تولید شده توسط هر گونه انجام شد (شکل 4-5 و جدول 4-4).

شکل 4- 5 تک کلنی های مخمری کشت داده شده روی محیط کشت CHA
جدول شماره 4-4 نمونه ای ازجنس احتمالی مخمرهای کشت یافته در محیط کشت CHA بر اساس رنگ کلنی

میکروسکوپی CHA جنس احتمالی
24 h 48 h
مخمر بنفش بنفش C.guilliermondi
مخمر سفید کرمی نارنجی Rhodotorula
مخمر صورتی سفید بنفش ساکارومایسس یا
C.glabrata
مخمر بنفش سفید بنفش ساکارومایسس یا
C.glabrata
مخمر سفید صورتی ساکارومایسس یا
C.glabrata
مخمر صورتی صورتی ساکارومایسس یا
C.glabrata
برای شناسایی قطعی جنس هر نمونه از محیط کشت CMA کمک گرفته می¬شود. ظاهر میکروسکوپی بلاستوکونیدی¬های ایجاد شده توسط بسیاری از مخمرها بر روی محیط کشت CMA اختصاصی می¬باشد؛ بنابراین براساس شکل