الیزا، لاندا

دانلود پایان نامه

فلورسانس می شود.[۱۲۲]
نتایج الیزا به صورت عددی گزارش می‌شود. بحث‌انگیزترین وجه این تست تعیین نقطه برش بین نتایج مثبت و منفی است.
علاوه بر هلیکوباکتر پیلوری از الیزا برای آزمایش بیماری‌هایی چون هپاتیت، تب استخوان‌شکن، لپتوسپیروسیس۵۷، HIV، عفونت انگلی، تبخال، سرخجه و دیگر عفونت‌های ویروسی و باکتریایی استفاده می‌شود.
تست الیزا با روش‌های گوناگونی انجام می‌شود که که به صورت کلی به دو دسته الیزا مستقیم و غیر مستقیم تقسیم بندی می‌شود. در روش مستقیم آنتی ژن یا آنتی‌بادی مورد نظر به طور مستقیم بر سطح فاز جامد پوشش داده می شود و سپس آنتی‌بادی یا آنتی ژن مکمل نشاندار شده آن به سیستم اضافه می‌شود. با آنالیز سیگنال تولید شده می‌توان پی به وجود آنتی ژن یا آنتی بادی مورد نظر در نمونه برد. این روش ارزش تشخیصی چندانی نداشته و بیشتر کاربرد تحقیقاتی دارد.[۱۲۲]
در روش غیر مستقیم سرم رقیق شده به آنتی ژن های پوشش داده شده در فاز جامد اضافه می شود، سپس نمونه را به آن اضافه کرده و پس از گذشت زمان انکوباسیون و یک مرحله شستشو، آنتی هیومن گلوبولین نشاندار شده با آنزیم به چاهک اضافه می شود. این روش برای تعیین آنتی بادی اختصاصی یا تیتراسیون آنتی بادی در سرم استفاده می‌شود. ‌
روش های الیزا ساندویچ و الیزا رقابتی یا مهاری از دیگر انواع متداول این تکنیک می باشند. روش ساندویچ که متداول‌ترین روش الیزا است، یک آنتی ژن در بین دو آنتی بادی اختصاصی قرار می گیرد. روش های رقابتی نیز بر پایه رقابت دو آنتی ژن یا دو آنتی بادی برای اتصال لیگاند با مقدار محدود استوار است. اگر اضافه کردن هردو آنالیت به سیستم همزمان انجام شود، روش را رقابتی می نامند ولی چنانچه ابتدا آنالیت اضافه شده و پس از یک دوره زمانی انکوباسیون آنالیت نشاندار اضافه گردد روش را مهاری می نامند.
برای انجام تست شستشودهنده باید نمونه خون از بیمار گرفته شود و سرم آن جدا شود. پیش از انجام آزمایش باید به کیفیت کیت های مورد مصرف توجه کرد، تمامی محلول‌های موجود در کیت قبل از مصرف بایدخوب مخلوط شده و به دمای آزمایشگاه برسد و پس از استفاده به منظور افزایش پایداری، بلافاصله اجزاء کیت به یخچال منتقل شود. درحین انجام آزمایش باید از نوسانات غیر تدریجی دما در هنگام انکوباسیون، مانند باز بودن پنجره یا درب آزمایشگاه در محل آزمایش جلوگیری کرد. ایجاد پدیده هوک باعث ایجاد نتایج پایین کاذب می‌شود لذا توصیه شده است برای جلوگیری از این پدیده سرم رقیق نشده و سرم یک دهم رقیق شده، مخلوط وآزمایش را انجام دهیم، تا اثر احتمالی هوک اصلاح شود. از آنجا که فریز و دیفریز کردن نمونه ها باعث کاهش سطح برخی از هورمون ها می‌شود، باید تا حد ممکن از این کار پرهیز شود. پیش از اندازه گیری باید کلیه ابزارهای مورد استفاده اعم از نوک ابزار نمونه‌گیری و کیت ها استریل شوند. که البته استفاده از ابزارهای یکبار مصرف پیشنهاد می‌شود و باید قبل از استفاده لوله آزمایش های شیشه‌ای آن‌ها را با اسید سولفوریک رقیق شستشو داده و با آب مقطری که دوبار تقطیر شده آبکشی انجام داد. از به کار بردن محلول‌های شستشوی نامناسب یا آب مقطر ناخالص باید پرهیز کرد. ضمنا باید از کارکرد صحیح دستگاه‌ها و تجهیزات مورد استفاده به عنوان مثال از صحت طول موج فیلترهای خواننده الیزا به کمک استفاده از ماده رنگی با ثبات، نظیر بیکرومات پتاسیم یا عملکردصحیح دستگاه شستشودهنده الیزا اطمینان حاصل کرد.
۳-۱۱-۲) شیکر الیزا۵۸
تکان دادن۵۹ میکروپلیت هااز مهم‌ترین بخش های تکنیک الیزا است، چرا که تاثیر زیادی در تغییر رنگ محیط آنزیمی پس از افزودن محلول اسیدی دارد. استفاده از روتاتور معمولی با قطر چرخش زیاد و تعداد دور کم و در نتیجه تکان دادن آهسته میکروپلیت‌ها باعث خوب مخلوط نشدن معرف‌ها و در نتیجه ادامه و پیشرفت جزئی واکنش در طی زمان و به روز خطا می‌شود. همچنین تکان شدید این پلیت ها نیز باعث آلوده شدن چاهک های میکرو پلیت با هم می‌شود. شیکر الیزا دستگاهی است که برای مخلوط کردن محتویات میکروپلیت‌ها به کار گرفته می شود. شیکر الیزا با حرکت سریع با قطر چرخش کم باعث اختلاط مناسب معرف‌ها و در نتیجه پیشرفت واکنش در طی زمان می‌شود. شیکرهای امروزی مجهز به سیستم کنترل زمان و کنترل دور به صورت دیجیتال است.
۳-۱۱-۳) شوینده الیزا۶۰
از دیگر مراحل مهم تست الیزا ، شستشو است که در هر مرحله از تست به منظور دفع و تخلیه کامل مولکول‌های غیر اختصاصی از محیط واکنش انجام می گیرد. شستشو به دو صورت دستی و خودکار انجام می شود. ابتدایی ترین روش شستشو، شستشوی دستی است بدین ترتیب که مایع شستشو را با پیپت بر روی چاهک ها ریخته و سپس آن را در سینک خالی می کنند. فشار بالای شستشو در روش دستی که به علت تخلیه سریع بافر به وجود میآید، منجر به جداشدن و حذف اتصالات اختصاصی از کف چاهک‌ها و کاهش کاذب می‌شود، همچنین فشار پائین‌شست‌شو ناشی از تخلیه آهسته بافر، باعث عدم دفع کامل اتصالات غیر اختصاصی و افزایش کاذب جذب نوری می‌شود. بهتر است در روش دستی تا نزدیک لبه فوقانی چاهک ها از محلول شستشو پر شود، در صورت پر شدن لب به لب چاهک‌ها، احتمال آلودگی چاهک به چاهک افزایش پیدا می‌کند. همچنین باید از سرریز شدن محلول شستشو، ایجاد حباب هوا در چاهک‌ها و تماس با کف چاهک جلوگیری کرد. در هنگام تخلیه چاهک‌ها نیز باید مکش و تخلیه به طور کامل انجام شد
ه و دقت شود که حتی ذره ای از مایع بافر در کف چاهک‌ها باقی نماند. اما این روش شستشو (شستشوی دستی) بسیار وقت گیر بوده و خطر آلودگی محیط و کاربر را در پی دارد. از این رو دستگاه‌های خودکار شوینده الیزا برای شستشوی پلیت ها به وجود آمده است که علاوه بر دقت و ایمنی بالاتر، سریع‌تر و راحت‌تر عمل شستشو را انجام می دهند. این دستگاه‌ها در انواع مختلف ۸ یا ۱۲ کاناله، تک سوزنه و دوسوزنه موجود است. در انواع دو سوزنه، یک سوزن برای ریختن و دیگری برای خالی کردن محلول شستشو استفاده می‌شود بدین ترتیب که یک سوزن به طور دائم در حال مکش است تا اگر مایع شوینده بیشتری در هنگام پر کردن وارد چاهک ها شد ، آن‌را خالی کند و این در حالی‌است که در مدل تک سوزنه تمامی اقدامات توسط همان یک سوزن صورت می گیرد.
۳-۱۱-۴) خواننده الیزا۶۱
خواننده الیزا در واقع یک دستگاه فتومتر است که در آخرین بخش از تست الیزا به طور اختصاصی برای خواندن نمونه های مربوطه طراحی شده است. وظیفه آن طیف‌سنجی نوری یا خوانش دانسیته نوری واکنش الیزا است. طول موج مشخصی از نور از پائین درون چاهک می‌گذرد، در مسیر آن فیلتر مناسبی باتوجه به نوع آنزیم و نوع سوبسترای آنزیم جهت دستیابی به طول موج مطلوب قرار داده می شود. در بسیاری از خوانشگرها سیستم تک موج یا دو موج است و جهت برطرف سازی نقص سیستم نوری ، تغییرات چاهک به چاهک حجم نهایی در چاهک ها، تصحیح جذب نوری به طور خودکار صورت می گیرد . این عمل توسط نوع خاصی از فیلترتحت عنوان فیلترهای تفاضلی صورت می گیرد. خوانش میزان جذب محتوی چاهک‌ها توسط خواننده الیزا الزاما بایستی در زمان تعیین شده انجام شود. بعضی از دستگاه‌های خواننده الیزا قابلیت برنامه‌ریزی زمانی، نوع تشخیص و کنترل و در نهایت مشخص کردن مثبت یا منفی بودن نمونه‌های مجهول را دارا هستند. ‌
امروزه انواع مختلفی از خوانشگرها برای پلیت ها ی الیزا در بازار موجود هستند اکثر این خوانشگرها یک ستونی یا ۹۶ خانه (یک پلیتی) بوده که اکثرا خودکار و تعداد اندکی نیز دستی هستند. این دستگاه‌ها دارای فیبرهای نوری هستند. در دستگاه‌های خواننده انتخاب طول موج توسط فیلترها یا گریدها (گریتینک ساختارهایی که با تابیده شدن نور به آن‌ها، تنها نور با طول موج خاصی ازآن‌ها ساطع می شود) انجام می شود. برای چاپ نتایج نمونه‌های موردآزمایش ، یا دستگاه خود دارای پرینتر است یا می توان آن‌را به پرینتری متصل کرد. همچنین می توان جهت انجام محاسبات بیشتر خواننده الیزا را به کامپیوتر وصل کرد.
۳-۱۱-۵) مراحل انجام آزمون الیزا که تقریبا در تمام انواع آن مشترک است عبارت است از
۱) پوشش دهی، که به معنی جذب یک آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی با سطوح جامد است.
۲) اضافه کردن نمونه‌های مورد آزمایش.
۳) گذشت مدت زمان کافی برای انجام واکنش که به اصطلاح انکوباسیون واکنشگرها نامیده می شود.
۴) انجام عمل شستشو توسط شستشودهنده الیزا ، به منظورجدا کردن واکنشگرهای متصل شده و واکنش داده از واکنشگرهای آزاد و متصل نشده‌.
۵) اضافه کردن عوامل لینک شده با آنزیم.
۶) طی مدت زمان انکوباسیون برای واکنشگرها‌.
۷)استفاده از شستشو دهنده الیزا جهت انجام عمل شستشو‌.
۸) افزودن سوبسترا آنزیم جهت تشخیص واکنش دهنده‌ها.
۹) طی زمان گرمخانه گذاری.
۱۰) اتمام واکنش آنزیمی توسط متوقف کننده‌ها و خوانش دانسیته نوری به دست آمده توسط خواننده شستشودهنده.
در این بررسی از کیت تشخیص IgG هلیکوباکتر پیلوری به روش الیزا ساخت شرکت Monobind با شماره شناسایی ساخت ۳۰۰-۱۴۲۵ استفاده گردید و تمامی مراحل طبق دستور راهنمای شرکت سازنده برای مصرف کنندگان انجام گرید. در این بررسی اعداد بدست آماده بالاتر از ۲۰ به عنوان مثبت درنظر گرفته گردید.
۳-۱۱-۶) روش کار با کیت Monobind Anti-H. Pylori IgG
۱- یک ساعت قبل از شروع تست، کیت را در دمای اتاق قرار داده(۲۰-۲۷ در جه سانتیگراد). قبل از شروع تست توصیه شده کلیه ویال ها (علی لخصوص استاندارد ها) را به آرامی چندین بار invert کرده تا بخوبی مخلوط گردند.
۲- محلول شستشو: جهت آماده سازی محلول شستشو محتویات یک ویال (۲۰ میلی لیتر) را با آب مقطر رقیق نمودهتا حجم کلی به ۱۰۰۰ میلی لیتر برسد،(به نسبت ۱ به ۵۰ رقیق می گردد)؛ و خوب مخلوط می نماییم. محلول فوق تا زمان انقضا در دمای اتاق قابل نگهداری می باشد. اگر قبل از آماده سازی محلول شستشو متوجه وجود کریستال هایی در داخل آن شدید، ویال را به مدت ۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه قرار داده. قابل ذکر است که محلول شستشو در کلیه کیت های Monobind مشترک بوده و از این محلول ساخته شده، جهت سایر کیت های Monobind نیز می توان استفاده کرد.
۳- آماده سازی سوبسترا: به میزان لازم حجم های مساوی از محلول A و B را با هم مخلوط کرده و به مدت ۱۵ دقیقه در محیط تاریک قرار داده (به عنوان مثال برای ۱۶ چاهک ، ۱ میلی لیتر محلول A و ۱ میلی لیتر از محلول B). باید دقت شود برای آماده سازی به هیچ وجه از لوله های Acid wash استفاده نگردد. محلول فوق حداکثر تا ۲۴ ساعت پایدار بوده وباید حتما در محیط تاریک و یا ویال کدر نگهداری گردد.
۴- Serum Diluent: جهت آماده سازی محلول Serum Diluent محتویات یک ویال (۲۰ میلی لیتر) را با آب مقطر رقیق نموده تا حجم کلی به (۲۰۰ میلی لیتر) برسد. به نسبت ۱ به ۱۰ رقیق میگردد.
توجه: پیشنهاد می گردد محلول فوق به صورت روزانه و به مقدار مورد نیاز آماده گردد.
۵- رقیق سازی نمونه های بیماران: نمونه های مورد آزمایش باید به نسبت ۱
به ۱۰۰ با محلول رقیق شده Serum Diluent رقیق شود.
برای این کا ۱۰ لاندا از نمونه سرم مورد آزمایش را به داخل تیوب ریخته، و ۱ میلی لیتر از محلول رقیق شده Serum Diluent را به آن اضافه کرده و خوب مخلوط کرده تانمونه های مورد آزمایش آماده گردد.
۳-۱۱-۷) مراحل انجام آزمایش H. Pylori IgG
۱- ۲۵ لاندا از نمونه استاندارد و یا کنترل را در داخل چاهک ریخته.
۲- ۱۰۰ لاندا از محلول کونژوگه بیوتین IgG (محلول سبز رنگ) را به همه چاهک ها اضافه کرده.
۳- پلیت را برای ۲۰ تا ۳۰ ثانیه به آرامی با دست روی سطح میز تکان داده تا کونژوگه به خوبی با سرم مخلوط گردد، سپس سطح چاهک ها را پوشانده تا در حین گرمخانه گذاری محتویات داخل چاهک ها تبخیر نگردد.
۴- پلیت را به مدت ۶۰ دقیقه در دمای اتاق گرمخانه گذاری کرده.
۵- محتویات داخل پلیت را تخلیه کرده.
۶- ۳۰۰ لاندا از محلول شستشوی رقیق شده را به همه چاهک ها اضافه نموده و سپس تخلیه نمایید. این مرحله را ۳ بار تکرار نموده.
۷- ۱۰۰ لاندا از محلول کونژوگه آنزیم Anti H.Pylori IgG (محلول قرمز رنگ) را به همه چاهک ها اضافه نموده.
۸- پلیت را برای ۲۰ تا ۳۰ ثانیه به آرامی با دست روی میز تکان داده و سپس سطح چاهک ها را بپوشانید تا در حین انکوباسیون محتویات داخل چاهک ها تبخیر نگردد.
۹- پلیت را به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق گرمخانه گذاری نموده.
۱۰- محتویات داخل پلیت را تخلیه نموده.
۱۱- ۳۰۰ لاندا از محلول شستشوی رقیق شده را به همه چاهک ها اضافه نموده و سپس تخلیه نمایید. ۶ عمل فوق باید ۳ مرتبه انجام پذیرد.
۱۲- ۱۰۰لاندا از محلول سوبسترای آماده شده( مخلوط A وB) را به همه چاهک ها اضافه نموده.
۱۳- پلیت را به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق و در محیط تاریک گرمخانه گزاری نموده.
۱۴- ۵۰ لاندا از محلول Stop را به همه چاهک ها اضافه نموده و پلیت را ۱۵ تا ۲۰ ثانیه به آرامی با دست، روی سطح میز تکان داده.
۱۵- پلیت را در طول موج ۴۵۰ نانومتر ( با طول موج رفرنس ۶۲۰ نانومتر) خوانده. قرائت نمونه ها باید حداکثر تا ۳۰ ثانیه پس از افزودن محلول stop صورت پذیرد.

مطلب مرتبط :   حمایت اجتماعی، روابط اجتماعی

فصل چهارم: نتایج

۴-۱ ) نتایج مربوط به افراد مورد مطالعه در این پژوهش
در طی مدت زمان ۸ ماه، ۵۲ بیمار کله سیستکتومی لاپاراسکوپی شده، و ۲۵ بیمار ERCP شده، با تکمیل فرم رضایت اخلاق پژوهش در علوم پزشکی، وارد این بررسی شده اند؛ نمونه های جمع آوری شده، به آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد شهرکرد انتقال یافت، مراحل کشت، استخراج DNA و واکنش های زنجیره ای پلیمرازی در این آزمایشگاه صورت گرفت. اطلاعات مربوط به هر بیمار

دیدگاهتان را بنویسید